Applications expérimentales et solutions de dépannage pour les tubes centrifuges d'ultrafiltration

Un tube centrifuge d'ultrafiltration est un dispositif de filtration membranaire couramment utilisé en laboratoire. Son composant principal est une membrane d’ultrafiltration avec un seuil de poids moléculaire spécifique. Les matériaux courants pour les membranes d'ultrafiltration comprennent le polyéthersulfone (PES) et la cellulose régénérée (RC). Le principe de fonctionnement du tube centrifuge d'ultrafiltration consiste à utiliser la force centrifuge et un tamisage basé sur la -taille moléculaire- pour entraîner de petites molécules à travers la membrane d'ultrafiltration, permettant ainsi une concentration, un dessalage, un échange de tampon ou une purification et une séparation rapides de biomacromolécules telles que les protéines et les acides nucléiques.

 

Sélection MWCO

Protéine	Recommandé MWCO	Temps de centrifugation recommandé
6 à 20 kDa	3 kDa	40 minutes
20 à 30 kDa	5 kDa	30 minutes
30 à 60 kDa	10 kDa	20 minutes
60-100 kDa	30 kDa	20 minutes
100-200 kDa	50 kDa	15 minutes
200 à 600 kDa	100 kDa	15 minutes
>600 kDa	300 kDa	15 minutes
Molécules d'acide nucléique simple- ou double-brin	Recommandé MWCO	Temps de centrifugation recommandé
137-1159 points de base	30 kDa / 100 kDa	10 minutes (rotor à angle fixe-, 5 000 × g)
Nanobilles	Recommandé MWCO	Temps de centrifugation recommandé
1,5 à 2 nm	3 kDa	40 minutes
2 à 3 nm	5 kDa	30 minutes
3 à 5 nm	10 kDa	20 minutes
5 à 7 nm	30 kDa	20 minutes
7 à 10 nm	50 kDa	15 minutes
10 à 30 nm	100 kDa	15 minutes
>30 nm	300 kDa	15 minutes

 

Pour les protéines, il est recommandé de sélectionner un MWCO membranaire 2 à 6 fois inférieur au poids moléculaire de la protéine cible. Si le débit est également pris en compte, un MWCO de membrane inférieur à cette plage 2×–6× est recommandé.

 

Cas d'application (ADN de cellules perdues)

Pour la méthode conventionnelle, un morceau de gaze de 2,5 cm × 2 cm a été coupé, lysé dans un système à petit volume - et directement purifié à l'aide de l'instrument. Pour la méthode de concentration, la zone d’échantillonnage de la gaze a été doublée. Après lyse, le surnageant de digestion a été transféré dans un tube centrifuge d'ultrafiltration de 100 kDa, concentré par centrifugation à 10 000 tr/min, récupéré par centrifugation inversée, puis soumis à une extraction d'ADN à l'aide d'un instrument de purification d'acide nucléique entièrement automatisé. Le volume d'élution a été uniformément fixé à 40 µL pour garantir que les niveaux de cellules initiaux dans les deux groupes étaient essentiellement comparables.

 

Les tests quantitatifs ont montré que la concentration moyenne d’ADN était de 0,099 ± 0,041 ng/μL pour la méthode conventionnelle et de 0,193 ± 0,068 ng/μL pour la méthode de concentration. La différence entre les deux groupes était statistiquement significative (P < 0,01). Le rendement total en ADN obtenu avec la méthode de concentration était 1,95 fois supérieur à celui de la méthode conventionnelle, démontrant que l’étape de concentration par ultrafiltration n’entraînait pratiquement aucune perte d’ADN total. Les valeurs Ct des deux groupes étaient respectivement de 27,64 ± 0,39 et 27,58 ± 0,40, avec P > 0,01, ce qui indique que le traitement par ultrafiltration n'a pas introduit d'inhibiteurs d'amplification PCR ni interféré avec les réactions d'amplification ultérieures.

 

Pour le génotypage STR, un génotype complet a été défini par des bandes complètes à chaque locus et une hauteur moyenne de pic supérieure ou égale à 200 RFU. Parmi 20 échantillons parallèles, la méthode conventionnelle a donné des génotypes complets pour seulement 14 échantillons, tandis que la méthode de concentration a permis d'obtenir un génotypage STR complet pour les 20 échantillons, améliorant considérablement le taux de détection efficace du génotypage des échantillons de contact traces.

Les tubes centrifuges d'ultrafiltration Guidling Technology se caractérisent par un fonctionnement simple, des facteurs de concentration élevés et des taux de récupération d'échantillons élevés, et sont largement utilisés en biochimie, en biologie moléculaire et dans d'autres domaines. Le taux de récupération des tubes centrifuges d'ultrafiltration Guidling Technology varie en fonction du matériau traité et peut généralement dépasser 90 %.

 

Dépannage courant

Problème	Cause possible	Solution
Les précipitations se produisent pendant la concentration	La concentration est trop rapide	Réduire la vitesse de centrifugation
		Utiliser un tube d'ultrafiltration avec un seuil de poids moléculaire plus élevé
		Pipeter de haut en bas dans le tube à centrifuger, puis centrifuger à nouveau
	Sur-concentration	Il est recommandé que la concentration finale en protéines après concentration ne dépasse pas 20 mg/mL.
L'eau ne peut pas être filtrée	La membrane d'ultrafiltration est complètement sèche et la surface de la membrane devient faiblement hydrophobe	Mouillez la membrane avec un solvant à faible tension superficielle-- (par exemple, effectuez une centrifugation initiale avec 20 % d'éthanol dans l'eau).
Aucune protéine cible n'est présente dans le concentré	La concentration initiale de l'échantillon de protéines est trop faible (< 25 μg/mL)	Si la concentration de l'échantillon est faible et le volume important, chargez l'échantillon et centrifugez à plusieurs reprises.
	Sélection MWCO de membrane incorrecte	Le MWCO membranaire est généralement inférieur à 2 fois le poids moléculaire de la protéine cible ou supérieur
	La force centrifuge est en dehors de la plage spécifiée	Force centrifuge recommandée : 3 000 à 5 000 × g
	La protéine cible a précipité	Ajustez la concentration en protéines cible dans le concentré (ajustez le facteur de concentration)
		Contrôler la température et le pH
		Utiliser des additifs
		Ajuster la force ionique
Des interférences se produisent lors de l'analyse en aval de protéines concentrées	La membrane d'ultrafiltration contient des traces de glycérol	Pré-rincer le tube d'ultrafiltration avec un tampon et de l'eau purifiée. Si l'interférence persiste, nettoyez avec du NaOH 0,1 M, puis rincez à l'eau purifiée et essorez.
Contamination par la RNase	Il n'est pas garanti que le tube d'ultrafiltration soit exempt de RNase-.	Il est recommandé de tremper dans 0,1 % DEPC à 37 degrés pendant 2 heures pour inactiver complètement la RNase ; Le DEPC résiduel peut être éliminé par rinçage à l’eau purifiée
Contamination par endotoxines	Les tubes d'ultrafiltration fournis n'ont pas subi de traitement d'élimination des endotoxines-, et les endotoxines sont largement présentes dans la nature.	Avant l'expérience, effectuez un pré-nettoyage avec du NaOH 0,5 M, suivi d'un rinçage à l'eau purifiée pour éliminer la plupart des endotoxines.